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受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡(STED)
熒光顯微鏡能夠以微結(jié)構(gòu)對細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行高度特異性成像，同時(shí)獲得最高對比度。然而，由于衍射極限的存在，常規(guī)顯微鏡的分辨率被限制在半波長左右。為突破分辨率限制，在過去的幾十年間產(chǎn)生了多種不同的方法，如通過不斷開啟和關(guān)閉單個(gè)熒光光斑、結(jié)構(gòu)化照明、光學(xué)波動(dòng)或用損耗光減小光斑發(fā)光面積等。
而STED技術(shù)是其中最為有效的光學(xué)超分辨方法之一。通過引入一束損耗光以受激發(fā)射的方式來抑制有效熒光的發(fā)射，STED可以實(shí)現(xiàn)超衍射極限的分辨率。自1994年Stefan W. Hell提出以來，STED技術(shù)已日趨成熟。
工作原理：
STED受激發(fā)射損耗顯微鏡技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)和材料領(lǐng)域，以突破衍射極限、實(shí)現(xiàn)高分辨的熒光樣品顯微。在共聚焦掃描顯微鏡中，樣品被一束衍射極限的脈沖激光激發(fā)，伴隨的圈狀二級(jí)光束則是發(fā)色團(tuán)發(fā)光時(shí)產(chǎn)生的紅移。
左：來自SUPERK的衍射極限激發(fā)光；中：來自Katana-HP的圈狀損耗光；
右：損耗后的超分辨率熒光信號(hào)。
這就能夠使得共聚焦激發(fā)光團(tuán)的外圈被耗散，而剩下的熒光就僅會(huì)從激發(fā)光團(tuán)的中心收縮處發(fā)射。
熒光信號(hào)的時(shí)間表現(xiàn)。上：圈狀光斑中央的最小值； 下：圈狀光斑帶損耗光后。
SUPERK超連續(xù)譜激光器能夠提供可見光(VIS)及近紅外(NIR)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜、優(yōu)秀的單模光束質(zhì)量(M2<1.1)和皮秒(ps)級(jí)別的脈寬。與NKT Photonics的濾光片技術(shù)結(jié)合后，就可以轉(zhuǎn)變?yōu)榭烧{(diào)諧激光器，從而優(yōu)化可將光和近紅外區(qū)域內(nèi)的每種光團(tuán)的吸收激發(fā)。
SUPERK激光器經(jīng)SUPERK SELECT后，在多個(gè)不同濾光范圍內(nèi)的超連續(xù)譜激光透過率
Onefive KATANA HP高功率皮秒激光器也適用于可見光-近紅外范圍內(nèi)的不同波長，能夠提供皮秒級(jí)別脈寬的激光脈沖，因此適用于作為STED的損耗光。
藍(lán)色：SUPERK Extreme EXW-12的光譜功率密度；紅色：KATANA HP激光器的可用波長
除了使用適當(dāng)?shù)牟ㄩL和激光功率組合外，在STED顯微鏡中，精確調(diào)節(jié)激發(fā)光和損耗光脈沖的同步也至關(guān)重要，從而實(shí)現(xiàn)在每個(gè)熒光周期開始時(shí)同步激發(fā)光團(tuán)的有效耗盡。
NKT Photonics的鎖模超連續(xù)譜激光器配備有NIM觸發(fā)輸出，內(nèi)置可調(diào)觸發(fā)延遲的標(biāo)準(zhǔn)功能。Onefive KATANA HP皮秒激光器可以作為外部觸發(fā)輸入的從屬激光器，從而允許通過軟件精準(zhǔn)、簡便的調(diào)整激勵(lì)和耗盡脈沖。
激發(fā)光和損耗光脈沖易于調(diào)制，可便捷地優(yōu)化損耗光以獲得最佳分辨率
在實(shí)驗(yàn)中，分辨率主要受所用發(fā)色團(tuán)的光物理限制，這也是熒光顯微發(fā)展迅速的原因。因此，超連續(xù)譜激光器自由選擇激發(fā)波長的靈活性有助于為Vis-NIR波段熒光顯微未來的發(fā)展做好準(zhǔn)備。
SuperK平臺(tái)與KATANA HP激光器系列產(chǎn)品的結(jié)合，是市場上STED熒光顯微產(chǎn)品的最佳交鑰匙解決方案之一，已經(jīng)通過全球多個(gè)案例的成功驗(yàn)證。其中最為知名的就是在德國徠卡顯微系統(tǒng)公司(Leica)的SP8 X共聚焦顯微鏡中的應(yīng)用，自2014年10月起Onefive已正式成為其脈沖受激發(fā)射損耗系統(tǒng)(STED)中775nm專用激光源的獨(dú)家供應(yīng)商。
共聚焦掃描顯微鏡圖像（左）與超分辨率STED圖像（右）的對比。來源于Leica TCS SP8 STED 3X顯微鏡(Courtesy of Leica Microsystems)。
適用于STED顯微鏡的硬件配置：
超連續(xù)譜激發(fā)光：
SuperK FIANIUM/ EXTREME
SuperK SELECT/VARIA
SuperK 保偏光纖傳輸
脈沖損耗光：
Onefive KATANA 08 HP(775 nm)
Onefive KATANA 06 HP(592 nm)
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